近日，中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室（LMB）研究員張長生團隊在多環(huán)大環(huán)內酰胺類天然產物生物合成酶學機制研究方面取得新進展。相關成果 “A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates” 在線發(fā)表于Angewandte Chemie (《德國應用化學》)
惰性C-H鍵活化是合成高價值化合物的關鍵環(huán)節(jié)，主要依靠過渡金屬催化，難以控制區(qū)域/立體/化學選擇性，一度被稱為有機化學中的“圣杯”。而在自然界中，少數(shù)細胞色素P450酶可以輕松有序地催化多步C-H鍵活化反應，且具有高度的區(qū)域/立體/化學選擇性，是形成許多重要天然產物的關鍵環(huán)節(jié)。這些P450酶被稱為多功能P450酶，是合成生物學應用的重要酶元件，但由于解析的復合物晶體結構有限，酶控制多步反應和精準選擇性的酶學機制仍有待闡明。以ikarugamycin為代表的多環(huán)大環(huán)內酰胺類天然產物(PoTeMs)是藥物先導化合物和生物農藥的重要資源。在PoTeMs生物合成中，P450酶介導的后修飾極大豐富了化學結構和生物活性。有趣的是，其中的多功能P450酶IkaD和CftA被報道都天然識別ikarugamycin（1），但得到不同的氧化產物：IkaD先氧化C7=C8雙鍵形成環(huán)氧，再羥基化C29，獲得產物capsimycin G（1b）；而CftA先催化形成C29酮基，再微弱催化C30羥基化反應獲得產物clifednamide C（1d）（圖1）。
為了揭開P450酶IkaD和CftA催化功能差異的神秘面紗，研究團隊首先解析了IkaD和CftA與共同底物1的復合結構。發(fā)現(xiàn)二者的整體三維骨架基本重合，是典型的金字塔形P450骨架，但參與構成催化口袋的FG區(qū)域的構象明顯不同，從而影響了催化口袋的形狀（圖1），使得同一個底物1朝向兩個酶血紅素鐵反應中心的距離和角度不同（圖2），最終決定了酶催化反應的區(qū)域和化學選擇性?；谶@一發(fā)現(xiàn)，研究團隊通過理性設計，對遠離血紅素鐵反應中心的極性氨基酸開展單點突變，發(fā)現(xiàn)IkaD的部分突變酶能夠改變催化反應的區(qū)域選擇性，形成天然分離未發(fā)現(xiàn)過的人工新產物。
圖1. 多功能P450酶IkaD和CftA對相同底物的不同區(qū)域/化學選擇性及其結構基礎
接著，研究團隊以不同骨架的PoTeMs底物開展系統(tǒng)性的體外酶學測試，發(fā)現(xiàn)IkaD和CftA都能識別催化非天然底物，但與區(qū)域選擇性不同。分別解析IkaD和CftA與非天然底物的復合物晶體結構（圖2），發(fā)現(xiàn)非天然底物并沒有誘導IkaD和CftA發(fā)生構象變化，保持了二者FG區(qū)域的構象差異，最終決定了對非天然底物的位點選擇性和反應順序。有趣的是，遠離血紅素鐵反應中心的極性氨基酸突變也顯著改變了IkaD對非天然底物催化反應的區(qū)域選擇性。
圖2. P450酶與不同骨架的PoTeMs底物在IkaD和CftA晶體結構中的結合模式
雖然參與組成P450酶催化口袋的BC和FG區(qū)域存在構象變化的現(xiàn)象已經(jīng)廣為人知，本研究首次發(fā)現(xiàn)了FG區(qū)域的構象差異導致同一底物1在IkaD和CftA催化口袋中以不同的姿勢朝向酶反應中心，造成了二者催化反應的區(qū)域選擇性和化學選擇性不同。這些發(fā)現(xiàn)為多功能P450酶如何控制位點選擇性、反應順序和反應類型提供了蛋白三維晶體結構方面的解答，并為P450酶理性改造提供了參考，對于認知海洋天然產物生物合成途徑和豐富海洋微生物酶元件庫具有重要的科學意義。
博士研究生蔣鵬和博士后金紅波為論文的第一作者，研究員張長生和副研究員張麗萍為共同通訊作者。以上研究工作得到了國家自然科學基金項目、廣東省自然科學基金、廣州市科技計劃項目和海南省重大科技計劃項目等的資助。
相關論文信息：Peng Jiang#, Hongbo Jin#, Guangtao Zhang, Wenjun Zhang, Wei Liu, Yiguang Zhu, Changsheng Zhang*, Liping Zhang*, A Mechanistic Understanding of the Distinct Regio- and Chemoselectivity of Multifunctional P450s by Structural Comparison of IkaD and CftA Complexed with Common Substrates, Angewandte Chemie, doi.org/10.1002/anie.202310728
文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202310728
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