北京時間3月18日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所婁春波課題組與北京大學物理學院定量生物學中心歐陽頎/錢瓏團隊合作在Nature Communications上發(fā)表精準控制哺乳動物細胞多個基因表達劑量的人工基因線路，題為“Precise programming of multigene expression stoichiometry in mammalian cells by a modular and programmable transcriptional system”。該工作通過在哺乳動物構建人工正交轉錄系統(tǒng)，實現(xiàn)了單個和多個啟動子轉錄活性的精準微調，構建了具有預測能力的多基因表達量的定量熱力學模型，并將這個定量模型應用于甲型流感病毒（H1N1）病毒樣顆粒（VLP）組分與產(chǎn)量的優(yōu)化設計。秦宸睿、項延會和劉杰為共同第一作者，中科院深圳先進院婁春波和北京大學錢瓏為文章共同通訊作者。
文章上線截圖
在哺乳動物細胞中，精確調控基因線路對于細胞適應環(huán)境、穩(wěn)態(tài)維持和發(fā)育分化等生理功能至關重要。關鍵基因表達量過量或不足都可能導致癌癥等重要疾病。此外，多個細胞命運決定因子表達劑量也是重塑細胞命運分化和發(fā)育的關鍵因素。然而，在哺乳動物細胞中，基因表達受到多種復雜因素的影響，例如：基因順序、基因組位置、表觀遺傳修飾和宿主細胞類型等，使得精確控制基因表達劑量變得非常困難。比如說，常用的啟動子EF1α的轉錄活性在HEK293T等七個細胞系中受到細胞類型的顯著影響；而CMV強啟動子在運動神經(jīng)元細胞中的表達活性會出現(xiàn)起始活性很高而隨后逐漸減弱的情況。因此，模塊化、不受細胞類型影響且可編程的基因表達系統(tǒng)成為哺乳動物細胞生物學和合成生物學研究中的重要瓶頸問題。
本文提出一種設計策略，旨在開發(fā)一種模塊化、獨立于宿主的正交型轉錄系統(tǒng)。該正交型轉錄系統(tǒng)由正交型啟動子庫和單體RNA聚合酶（RNAP）組成。該系統(tǒng)通過將RNA加帽酶與單體RNAP融合，可確保原核來源的單體RNAP在哺乳動物細胞中按照“跨域（domain）”方式實現(xiàn)基因轉錄、轉錄后修飾、出核和翻譯等真核系統(tǒng)蛋白質表達的必需步驟（圖1）。
本論文發(fā)現(xiàn)了不同基因表達活性的競爭效應，并建立了定量的熱力學模型。針對兩個基因的競爭問題，研究團隊設計了一個哺乳動物細胞系中的兩個報告基因（圖2）。在這個雙報告基因體系中，每個報告基因由正交型啟動子庫中的七個代表性啟動子之一控制，共有49種不同的組合。實驗結果發(fā)現(xiàn)一個基因的強啟動子顯著降低了另一個基因的表達。這個結果證明了兩個報告基因在競爭有限資源（ [RNAP]free）。因此，本論文提出了利用[RNAP]free取代的[RNAP]tot的新型熱力學方程式（圖2e）。
在哺乳動物細胞中，多個基因的先后順序也會顯著影響基因表達量。為了研究基因先后順序對基因表達量的影響，研究團隊設計了三個報告基因的六種可能的先后順序（1-2-3， 1-3-2， 2-1-3， 2-3-1， 3-1-2， 3-2-1），并計算了報告基因在所有六種組合中的表達量的方差 (圖3)。作者們發(fā)現(xiàn)同一啟動子的表達量的方差系數(shù)(CV) 非常小。這個結果表明啟動子活性不受其局部基因環(huán)境的顯著影響，而且在CHO和HEK293T細胞株中都保持類似行為。另外，研究團隊在50個啟動子庫中，針對三個不同報告基因任意選擇其啟動子（活性變化100倍左右）。通過修正的熱力學模型，文章預測了三種報告基因的活性。根據(jù)實驗結果發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中的三個基因的蛋白表達量都可以由模型預測（R2=0.81~0.88）。
為證實正交轉錄系統(tǒng)的優(yōu)勢，研究團隊使用定量熱力學模型優(yōu)化了病毒樣顆粒的多個亞基的基因表達劑量。病毒樣顆粒（VLP）是由多個蛋白質組成的無病原性并且不能進行復制的納米顆粒。在疫苗和藥物傳遞等生物醫(yī)學領域具有廣泛的應用潛力。多個蛋白亞基的表達水平對于VLP的組裝效率和免疫原性至關重要。因此，團隊研究了表達水平的可編程性以及它對VLP產(chǎn)量的影響。首先，作者們驗證了在適當?shù)谋磉_劑量條件下，甲型流感病毒的三個關鍵亞單位（血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）和基質蛋白1（M1））可以形成穩(wěn)定的VLP。然后，構建了兩個融合基因（egfp-M1和NA-mCherry），用于定量表征VLP的產(chǎn)量和完整度。接著，使用修正后的定量熱力學模型預測了所有預設啟動子參數(shù)和基因特異性參數(shù)的VLP產(chǎn)量（共157,464個組）。通過虛擬篩選和理論分析，研究團隊發(fā)現(xiàn)HA基因的高表達對產(chǎn)生VLP有害，而適當表達的三個基因則可以產(chǎn)生更多的VLP顆粒。最后，團隊選擇了十余組高產(chǎn)組合進行實驗驗證，結果發(fā)現(xiàn)所有組合都產(chǎn)生了更多的VLP顆粒，并且實驗結果與預測值相符，其中預測值越高實驗結果越好。
綜上所述，本研究開發(fā)了一種模塊化、可編程的正交型轉錄調控系統(tǒng)。此外，該研究還建立了基于胞內資源競爭和結合能的定量熱力學理論模型，可以實現(xiàn)對哺乳動物細胞中多個基因表達劑量的精確設計和預測。通過利用這種正交型轉錄系統(tǒng)，研究團隊還成功地優(yōu)化了甲型流感病毒病毒樣顆粒（VLP），為新型高效甲型流感疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)提供了潛力。
該工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目，國家自然科學基金，中科院先導計劃、青年交叉團隊項目和深圳合成生物學創(chuàng)新研究院的資助。
圖1. 正交型啟動子庫和跨物種通用轉錄系統(tǒng)的構建和定量模型的實驗驗證
圖2. 哺乳動物細胞內關鍵因子的共享造成多個啟動子活性的競爭效應和相關定量熱力學模型
圖3. 基因先后順序對正交型轉錄系統(tǒng)的影響很小，及相關定量熱力學模型的預測性
圖4. 甲型流感病毒的病毒樣顆粒（VLP）的三個亞基基因的表達劑量的可預測優(yōu)化與實驗驗證
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